鸽子飞行能力基因检测试剂盒（PCR-荧光探针法）使用说明书
【赛鸽飞行能力鉴定试剂产品名称】
通用名称：鸽子飞行能力基因检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
【赛鸽飞行能力鉴定试剂预期用途】
本试剂盒用于鸽子飞行能力基因定性检测，可对鸽子的飞行能力进行预测。
【赛鸽飞行能力鉴定试剂检测原理】
根据鸽子飞行能力基因设计特异性引物和探针，利用荧光定量PCR技术，通过检测荧光的释放和强度，来检测飞行能力基因。
【试剂盒组成】
本产品由特异性引物探针、Taq酶以及反应缓冲液组成。
【主要组成成分】
序号 | 组分 | 标示装量/管 | 数量（管） |
1 | 10 x qPCR Buffer | 400ul | 1 |
2 | dNTP(2.5mM) | 240 ul | 1 |
3 | Hot Star Taq (5u/ul) | 30 ul | 1 |
4 | LDHA引物探针 | 200 ul | 1 |
5 | DRD4a引物探针 | 200ul | 1 |
6 | DRD4b引物探针 | 200ul | 1 |
【储存条件及有效期】
-20℃避光保存有效期为12个月；切忌反复冻融。
【样本要求】
1、羽毛：采集胸部或腹部或腿部羽毛2根，切忌使用自然脱落的羽毛。
2、全血：使用EDTA作为抗凝剂，切忌使用肝素抗凝。要求使用新鲜全血，或在2～8℃保存不超过7天，或在-20℃以下保存不超过一个月，应尽量避免反复冻融。
【检验方法】
1、样本处理与核酸提取，具体操作参照相关操作说明书。
（1）0.2ml PCR管中，加入羽毛2-4根，加入Reagent A 20ul（注意淹没样本），99℃加热20分钟；
（2）向上一步的Pcr管中加入Reagent B 100ul，5000rpm离心30秒-1分钟，备用；
2、仪器准备将每台仪器接通电源，检查是否运转正常。
3、物品准备：离心机、冰盒、移液器、吸头；试剂准备（未分装规格使用）：将PCR反应液解冻、混匀，瞬时离心后分装14µL/管。
序号 | 组分 | 用量 | 反应液 |
1 | 10 x qPCR Buffer | 2ul | 14ul反应液 |
2 | dNTP(2.5mM) | 1.6 ul | |
3 | Hot Star Taq (5u/ul) | 0.2 ul | |
4 | 去离子水 | 10.2 ul |
管号1 | 管号2 | 管号3 |
14ul反应液 | 14ul反应液 | 14ul反应液 |
4ul LDHA引物探针 | 4ul DRD4a引物探针 | 4ul DRD4b引物探针 |
2ul DNA模板 | 2ul DNA模板 | 2ul DNA模板 |
4、PCR扩增条件（反应体系为20μL）
扩增温度 | 扩增时间 | 循环数 |
95℃ | 5min | 1 |
95℃ | 15sec | 40cycles |
60℃ | 30sec（采集荧光）FAM及VIC |
5、荧光定量检测
结果判定
反应液 | 飞行能力基因基因型 | ||
野生基因型 | 杂合基因型 | 突变基因型 | |
管号1 LDHA基因 | GG | AG | AA |
管号2 DRD4a基因 | CC | CT | TT |
管号3 DRD4b基因 | CC | CT | TT |
FAM VIC信号判断 | VIC＜33，FAM无ct | FAM-VIC绝对值＜3 | FAM＜33，VIC无ct |
备注 | FAM可能有ct，FAM-VIC绝对值＞5 | VIC可能有ct，FAM-VIC绝对值＞5 | |
【检验方法局限性】
本方法只适用于鸽子飞行能力基因检测。
【产品性能指标】
1. 特异性：对特异性参考品进行检测，所有参考品检测结果阴性。
2. 准确性：对检测范围内的不同基因型的参考品进行检测，能检出相应基因型。
3. 最低检出限：应不高于5ng/µL。
4. 重复性：检测范围内的不同基因型的重复性参考品，每个参考品进行10次检测，结果能准确分型，且相应检测结果Ct值的变异系数（CV）应≤5.0%。
5. 有效期：试剂盒于-20避光保存，有效期为12个月。
【注意事项】实验前请仔细阅读说明书
1.本试剂盒仅鸽子飞行能力基因体外检测。有关实验室管理规范严格按照行政主管部门颁布的有关基因扩增检测实验室的管理规定执行。
2.试剂盒应低温运输和保存，试剂盒内各试剂使用前，请短暂离心。
3.检测时，提取样本必须在生物安全柜中进行，且使用时要注意横向污染。
4.实验应严格分区操作：第一区：试剂制备区—准备扩增所需试剂；
第二区：样本处理区—待测样本和对照品处理；
第三区：PCR扩增区—PCR扩增检测。
本产品为一次性用品，使用后的试剂盒和样本等废弃物应作为传染源按照国家相关法律法规处理。
